Question

[Ánh Sao]

Trình bày phương pháp nhuộm Gram

Answer 1

[Ngô Thị Hương Giang]

1. Nguyên lý Dựa trên sự khác nhau về cấu trúc của vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương sẽ giữ được phức hợp tím gentians-iod không bị tẩy màu bởi alcohol, trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ được phức hợp này. Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram dương vẫn giữ được màu tím của gentians, còn vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng của fucshin. 2. Dụng cụ, thiết bị Kính hiển vi, que cấy đầu tròn, đèn cồn, diêm, phiến kính (slide), chậu rửa, bình xịt nước cất và các dụng cụ cần thiết. 3. Vật liệu, hoá chất (1) Các loài vi khuẩn hoặc các hỗn dịch các vi khuẩn này. Vi khuẩn Gram âm: E.coli, Salmonella,..; Gram dương: S. aureus, Bacillus cereus; dịch cơ thể hoặc mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn. (2) Dung dịch tím gentians (3) Dung dịch Lugol (4) Dung dịch alcohol 90% (5) Dung dịch fucshin kiềm

Pha thuốc nhuộm tím gentians: + Tím gentians nồng độ 1/10 trong cồn ethylic 95[sup]0[/sup] 10ml + Acid phenic 1ml + Nước cất 100ml Lắc đều, lọc qua giấy lọc. Pha dung dịch lugol: + Iod 1g + Kali iodid (KI) 2g + Nước cất 5ml Nghiền tan trong cối sứ rồi cho thêm nước cất cho đủ 200ml Pha thuốc nhuộm Fucshin kiềm: + Fucshin kiềm nồng độ 1/10 trong cồn ethylic 95[sup]0[/sup] 10ml + Acid phenic 5ml + Nước cất 100ml Lắc đều, lọc qua giấy lọc.

4. Các bước tiến hành Bước một, dàn tiêu bản và cố định tiêu bản: Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng (hoặc dịch cơ thể, mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn) hoà vào 1 giọt nước muối sinh lý ở giữa phiến kính, để khô trong phòng thí nghiệm. Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính. Việc cố định nhằm 3 mục đích: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống. Bước hai, nhuộm màu: - Thứ nhất, nhuộm bằng dung dịch tím gentians trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước; - Thứ hai, nhuộm thêm dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước; - Thứ ba, khử màu: nhỏ dung dịch alcohol 90%, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước; - Thứ tư, nhuộm tiếp bằng dung dịch Fucshin trong 1 phút, rửa nước, để khô. * Kết quả: quan sát ở vật kính dầu 100x. Nếu nhuộm đúng vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, Gram âm bắt màu hồng. 5. Giải thích tính bắt màu Gram của vi khuẩn Vi khuẩn Gram dương có vách tế bào dày từ 15 đến 50 nm, dạng lưới, cấu tạo bởi peptidoglycan. Chất này có khả năng giữ phức hợp tím gentians - iod. Trong khi đó, lớp vách tế bào peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharde (LPS) bên ngoài.

Answer 2

[Uyên Nhi]

1. Làm tiêu bản mẫu cần nhuộm.
2. Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn.
3. Dùng thuốc nhuộm kiềm, tím tinh thể hay tím gentian nhuôm mẫu trong 1 phút.
4. Rửa nước tối đa 5 giây.
5. Thêm dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 1 phút.
6. Rửa bằng rượu trong 10 giây.
7. Phủ lên mẫu với ethanol 95% (hoặc hỗn hợp acetone:ethanol 95% 5:1) vài lần cho đến khi không xuất hiện thêm màu trong mẫu (khoảng 1 phút). Dung dịch này sẽ rửa sạch thuốc nhuộm kiềm không kết gắn, vi khuẩn Gram dương giữ lại màu tím, còn vi khuẩn Gram âm mất màu.
8. Rửa nước.
9. Nhuộm tiếp với safranin hoặc fuchsin. Cả hai nhóm vi khuẩn đều bắt giữ thuốc nhuộm lần này, nhưng vi khuẩn Gram dương không bị thay đổi màu nhiều, trong khi vi khuẩn Gram âm trở nên đỏ vàng (nhuộm safranin) hay đỏ tía (fuchsin). Thời gian: 1 phút theo tài liệu mới nhất.
10. Rửa qua nước. Để khô.