Thực hành: Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật SVIP

I. Chuẩn bị

1. Mẫu vật

- Một số chủng vi sinh vật:

• Dịch nuôi cấy hoặc môi trưởng lỏng chứa chủng vi sinh vật cần phân tích.

- Một số dung dịch chỉ định nuôi cấy vi khuẩn đã được đồng nhất.

• Dung dịch nuôi cấy bề mặt là môi trường rắn: dung dịch mẫu chứa thạch (từ 1,5 - 2 %) trong ống thạch nghiêng hay trong đĩa petri.
• Dung dịch nuôi cấy sâu trong môi trường rắn: dung dịch mẫu trong ống nghiệm thạch sâu chứa thạch mềm (0,5 - 0,7 %).

2. Dụng cụ cấy

- Que cấy thẳng: Que cấy kim loại có đầu nhọn, dùng để cấy vi khuẩn có tạo khuẩn ti.

- Que cấy móc: Đây là que cấy có đầu vuông góc, dùng để cấy vi khuẩn có tạo khuẩn ti.

- Que cấy vòng: Là que cấy kim loại đầu có vòng tròn, dùng cấy chủng từ môi trường rắn hoặc lỏng lên môi trường rắn, lỏng.

- Que cấy trang: Là que bằng kim loại hay thuỷ tinh, đầu tam giác, dùng để dàn trải vi khuẩn trên bề mặt thạch rắn.

- Ống hút thuỷ tinh: Dùng để chuyển một lượng vi khuẩn cần thiết lên bề mặt môi trường rắn hoặc môi trường lỏng.

- Đầu tăm bông vô trùng: Dùng để cấy giống từ môi trường lỏng lên bề mặt môi trường rắn.

3. Hoá chất

- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật có sẵn: thạch đĩa, thạch đứng, thạch nghiêng hoặc môi trường lỏng.

II. Các phương pháp phân lập, nuôi cấy vi khuẩn

1. Kĩ thuật cấy ria trên đĩa petri

- Bước 1: Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng nhúng vào dịch mẫu để có các vi khuẩn muốn phân lập (xem thao tác 1 và 2).

- Bước 2: Ria các đường trên đĩa petri có chứa môi trường thạch thích hợp. Sau mỗi đường ria liên tục, đốt khử trùng que cấy và làm nguội trước khi thực hiện thao tác tiếp theo (xem thao tác 3, 4, 5 và 6).

- Bước 3: Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp trong tủ ấm (xem thao tác 7 và 8).

2. Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa môi trường lỏng

- Bước 1: Vô trùng que cấy.

• Đốt nóng đỏ đầu que cấy trên ngọn lửa đèn cồn, hơ nhẹ phần cán, rồi cầm thẳng đứng que cấy cho que cấy nóng đều.
• Tay thuận cầm que cấy và làm nguội que cấy.

- Bước 2: Lấy sinh khối ra khỏi ống dịch mẫu

• Tay không thuận cầm ống nghiệm chứa dịch mẫu. Dùng ngón út của tay thuận xoay nhẹ để mở nút bông, sau khi mở nút bông, xoay miệng ống nghiệm qua ngọn lửa đèn cồn và đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm.
• Nhúng que cấy vào môi trường lỏng, rút thẳng que cấy ra (không để dính vào thành và miệng ống nghiệm) để thu sinh khối. Hơ nóng miệng ống nghiệm và đậy nút bông lại rồi đặt ống nghiệm vào giá đỡ.

- Bước 3: Cấy giống vi khuẩn vào môi trường lỏng mới

• Đầu que cấy vi khuẩn được giữ ở vùng không khí vô trùng gần ngọn đèn cồn.
• Dùng tay không thuận lấy ống nghiệm chứa môi trường mới rồi mở nút bông và khử trùng miệng ống nghiệm.
• Đưa đầu que cấy vào bên trong môi trường, nhúng và khuấy nhẹ nhàng que cấy trong dịch môi trường để tách sinh khối ra khỏi que cấy.
• Rút thẳng đầu que cấy ra. Khử trùng que cấy ngay sau khi cấy xong.
• Khử trùng miệng ống nghiệm và đậy nút bông.
• Khử trùng miệng ống nghiệm và đậy nút bông.

3. Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống thạch nghiêng

- Phương pháp này tiến hành tương tự như trên, nhưng có khác biệt ở Bước 3:

• Trên bề mặt thạch nghiêng đặt nhẹ đầu que cấy từ đáy ống nghiệm, cấy theo hình chữ chi lên đến đầu ống nghiệm.

4. Kĩ thuật cấy trang

- Bước 1: Vô trùng thanh gạt (que cấy trang).

• Nhúng đầu thanh gạt vào cồn và hơ qua ngọn lửa đèn cồn để khử trùng. Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.

- Bước 2: Lấy vi sinh vật trong dịch mẫu bằng micropipette.

• Mở đĩa petri, bơm dịch vi khuẩn từ micropipette lên mặt thạch.
• Nhẹ nhàng đặt thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu thanh gạt trải đều dịch vi khuẩn lên trên bề mặt thạch.

- Bước 3: Ủ vi sinh vật.

• Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp trong tủ ổn nhiệt.

5. Cấy giống từ môi trường lỏng bằng micropipette đầu rời

- Ưu điểm: Micropipette đầu rời cho phép thao tác chính xác với những dung tích nhỏ và tiện dụng khi thao tác trong môi trường vô trùng.

- Yêu cầu kĩ thuật:

• Khi sử dụng micropipette đầu rời để cấy chuyển dịch giống thì cần phải tiến hành trong không gian vô trùng của ngọn lửa đèn cồn trong tử cấy.
• Mỗi micropipette đầu rời đều có giới hạn dung tích thao tác cho phép nhất định nên cần chọn micropipette đầu rời thích hợp cho phạm vi thao tác.
• Mỗi micropipette đầu rời có hai nấc: Nấc 1 sử dụng khi hút dung dịch; nấc 2 (vượt quá nấc) dùng để bơm dung dịch ra khỏi đầu tip.

  

- Thao tác cấy vi khuẩn:

Bước 1: Chuẩn bị micropipette.

• Tay thuận cầm micropipette đầu rời, tay không thuận mở hộp chứa đầu tip vô trùng. Sau đó, cắm đầu micropipette vào đầu tip.
• Đầu micropipette và đầu tip cần phải đảm bảo vô trùng tuyệt đối để tránh nhiễm khuẩn.

Bước 2: Lấy vi khuẩn trong dịch mẫu.

• Dùng tay trái giữ ống nghiệm hay bình chứa dịch giống vi sinh vật.
• Dùng ngón úp, áp út của tay thuận đang giữ micropipette để kẹp giữ và mở nút bông, sau đó hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm hoặc bình chứa.
• Đưa đầu tip vô trùng vào bên trong dịch giống rồi hút lấy dung dịch cần thiết.
• Sau đó, rút đầu tip ra khỏi miệng bình chứa, khử trùng miệng bình chứa và nút bông lại (nút bông vẫn đang được giữ ở ngón út và áp út tay thuận).

Bước 3: Cấy vi khuẩn vào dịch mới.

• Đầu tip có chứa vi sinh vật cần được giữ ở vùng không khí vô trùng gần ngọn đèn cồn.
• Dùng tay không thuận lấy ống nghiệm hoặc bình chứa môi trường mới, dùng ngón út và áp út của tay thuận kẹp và mở nút bông, khử trùng miệng bình chứa.
• Đưa đầu tip vào bên trong môi trường rồi bơm dịch giống vào môi trường.
• Rút đầu tip ra khỏi miệng bình chứa, khử trùng miệng bình và đậy nút bông lại.

- Nguyên tắc đảm bảo kết quả tối ưu cho nuôi cấy vi sinh vật:

• Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của mỗi loài vi khuẩn và duy trì ổn định nhiệt độ này.
• Độ ẩm tối ưu trong quá trình nuôi ủ và cần đảm bảo đủ lượng nước duy trì độ ẩm.
• Khí oxy cần thiết đối với vi sinh vật hiếu khí nên môi trường nuôi cấy cần có độ dày vừa phải để oxy không khí có thể thấm vào.

III. Báo cáo kết quả thực hành